مغز مرتبط است (دراگونو92،1985،ص480-487).
2-4-7- سروتونين
سروتونين93‏ يا هيدروکسي‌تريپتامين يکي از انتقال‌دهنده‌هاي عصبي منوآميني است که توسط نورون‌هاي دستگاه گوارشي و دستگاه عصبي مرکزي ترشح مي‌شود(شکل2-3). سروتونين نوروترانسميتر تعديلي در مغز است که در اعمال مهي مانند خواب، تنظيم دما، تغذيه و حالت رفتاري نقش دارد(جواديان،2004،ص189-200). در مغز پستانداران سروتونين توسط نورونهاي واقع در هسته رافه موجود در ساقه مغز توليد مي شوند که فيبرهاي اين هسته به نواحي زيادي از مغز بويژه پياز بويايي تالاموس، هيپوتالاموس، استرياتوم، قشر و هيپوکمپ گسيل مي شوند(لوسچر،1997). در هيپوکمپ شکنج دندانه دار بويژه لايه مولکولي، ناحيه زير دندانه اي94 و ناحيه هيلوس تراکم بسيار زيادي از گيرنده هاي سروتونيني را دارد(ماسوکاوا و همکاران95،1989).
شکل2-3: ساختار شيميايي شماتيک سروتونين
2-5- سيستم سروتونرژيک و صرع
گيرنده هاي سروتونين، همچنين به عنوان گيرنده هاي 5- هيدروکسي تريپتامين96و يا گيرنده هاي 5-HT شناخته مي شوند؛ که هم نقش مهاري هم نقش تحريکي دارند. گيرنده 5-HT1A يک زير گروه از گيرنده هاي 5-HT است، اين گيرنده در سيستم اعصاب مرکزي، قشر مخ، هيپوکامپ، سپتوم، بادامه مغز، و هسته رافه در تراکم هاي بالا، در حالي که مقدار کمي نيز در گانگليون بازال و تالاموس وجود دارد. فعال سازي گيرنده 5-HT1A باعث آزادي يا مهار نوراپي نفرين از لوکوس سرولئوس مي شود که بسته به نوع آنتاگونيست آن متفاوت است.
نورون هاي سيستم سروتونرژيک به صورت دسته هاي بزرگي در پل مغزي، قسمت فوقاني بصل النخاع و نزديک به هسته رافه97 قرار دارند. در اکثر مناطق مغزي سروتونين داراي اثر مهاري قوي مي باشد. اين اثر با هيپرپولاريزاسيون غشاء همراه است(ملدروم،1989،ص1-11؛دراگونو،1985،ص480-487).
مطالعات بسياري مبني بر افزايش سروتونين و متابوليت آن پس از مصرف داروهاي ضد تشنج انجام شده است، مشخص شده است روش هايي که سبب افزايش سروتونين مي شوند، در مدل هاي حيواني صرع اثر محافظت کننده نشان مي دهند (ملدروم،1989،ص1-11). به عبارت ديگر سيستم سرتونرژيک و تحريک گيرنده هاي سروتونيني شدت حملات تشنجي را کاهش مي دهد و شروع تشنجها را به تأخير مي اندازد(بارن و همکاران،1991،ص157-162؛ دراگونو،1985،ص480-487). تزريق داخل هيپوکمپي آگونيست سروتونين (گيرنده 5-HT1A) مدت زمان امواج تخليه متعاقب را کاهش داد و آستانه اين امواج را افزايش داد (جانوس و کلينورک،1989،ص144-153). در مطالعه اي که در مورد اثر آنتاگونيست گيرنده هاي سروتونيني صورت گرفت نشان داده شد که آنتاگونيست گيرنده هاي 5-HT2A, 5-HT3 , 5-HT2B,C آستانه تشنجات ناشي از کيندلينگ شکنج دندانه دار را تغيير نمي دهند؛ اما آنتاگونيست گيرنده 5-HT1A شدت تشنجات را افزايش مي دهد. در مدل تشنجي پيلوکارپين تزريق آگونيست گيرنده 5-HT1A آستانه تشنج را در موشها افزايش داد و پيش درماني با آنتاگونيست اين گيرنده ها (WAY-100635) اثر مهاري آگونيست گيرنده 5-HT1A را بر تشنجهاي ناشي از پيلوکارپين مهار کرد(وادا و همکاران98،1993).
با توجه به نقش گيرنده سروتونيني 5-HT1A در فعاليت سيناپسي و در نتيجه اهميتي که در مدل هاي تشنجي دارد، از طرفي با توجه به تشابه مکانيسم هاي در گير در ايجاد حملات تشنجي و تقويت طولاني مدت (Long Term Potentiation; LTP) هدف از مطالعه حاضر بررسي نقش اين گيرنده در تقويت سيناپسي ناشي از پنتيلن تترازول (Pentylenetetrazol; PTZ) است.
فصل سوم
مواد و روش ها
3-1- آماده سازي مواد و وسايل لازم
در اين تحقيق براي ثبت پتانسيل هاي ميداني برانگيخته درمسير پرفورنت الكترود دو قطبي تحريکي و در شکنج دندانه دار الکترود ثبات قرار داده شد و براي تزريق دارو نيز در داخل بطن جانبي يک كانول كار گذاشته ‌شد. بنابراين، قبل از انجام جراحي حيوانات، بايد الكترودها و كانول هاي لازم براي جراحي تهيه مي گرديد.
3-1-1- تهيه الكترود
براي انجام آزمايش به يک الكترود دو قطبي و يک الكترود تك قطبي براي هر حيوان نياز بود. اين الکترودها از به هم تاباندن طول مناسبي از دو رشته سيم الکترود (با قطر 127 ميكرون) از جنس فولاد ضد زنگ Stainless steel با پوشش تفلوني تهيه مي شد. عايق انتهاي سيم ها به اندازه 25/0 تا 5/0 ميليمتر برداشته شده و سپس به پين لحيم مي گرديدند. از اين الكترودها براي تحريك مسير پرفورنت و ثبت از شكنج دندانه دار استفاده مي شد.
پس از ساختن الکترودها، براي اطمينان از سالم ماندن پوشش عايق سيم الکترود يک سر اهم متر را به پين وصل نموده و سر ديگر آن که به يک حلقه فلزي متصل بود، در آب فرو برده مي شد تا يک لايه از آب سطح حلقه را بپوشاند. سپس الکترود از ميان حلقه فلزي و لايه آب عبور داده مي شد. اگر در طول الکترود پوشش عايق از بين رفته بود، جريان برقرار مي گرديد و اهم متر آن را نشان مي داد.
3-1-2- تهيه كانول
براي تزريق دارو به داخل بطن جانبي از سرسوزن G 27 دندانپزشکي به عنوان كانول تزريق و از سر سوزن G 22 به عنوان كانول راهنما استفاده مي‌گرديد. پس از اينكه سر سوزن G 22 به طول مناسب بريده مي‌شد، طول سر سوزن G 27 به گونه‌اي اندازه گيري مي گرديد كه پس از قرار گرفتن در كانول راهنما (سرسوزن G22) نوك آن به اندازه يك ميلي متر از نوك كانول راهنما بلندتر باشد. به منظور قرار گرفتن كانول تزريق در محل مورد نظر، كانول راهنما هنگام جراحي در فاصله يك ميلي متر بالاتر از منطقه مورد نظر قرار گرفته و توسط سيمان دندانپزشكي ثابت مي‌شد.
3-1-3- آماده سازي دارو
3-1-3-1- داروي مورد استفاده
در اين تحقيق از WAY-100635 (CPT؛ خريداري شده از شرکت Sigma) به عنوان آنتاگونيست اختصاصي گيرنده سرتونيني 5-HT1A استفاده شد.
3-1-3-2- تهيه دوزهاي مختلف دارو
دارو براي تزريق به داخل بطن جانبي مغز در مايع مغزي- نخاعي مصنوعي (حلال دارو) حل مي‌شدند. مواد تشکيل دهنده حلال دارو عبارت بود از: NaCl (114mM)، MgSO4 (2mM)، KCl (3mM)، NaH2PO4 (1.25mM)، CaCl2 (1mM)، NaHCO3 (26 mM) و Glucose (10mM).
هنگام تهيه حلال دارو، گلوكز و NaHCO3 مدت كوتاهي قبل از تزريق دارو به محلول فوق اضافه مي‌شدند، زيرا وجود گلوكز محيط مناسبي براي رشد باكتري‌ها و قارچها فراهم مي‌كند و NaHCO3 پايدار نيست و CO2 را از دست مي‌دهد. پس از تهيه حلال دارو، براي تهيه دوزهاي مختلف دارو، ابتدا مقدار مورد نياز از دارو وزن شده، در حجم معيني از حلال دارو حل مي‌گرديد و سپس با استفاده از pH متر و HCl يك نرمال، pH محلول در حد 4/7-2/7 تنظيم مي‌شد.
به منظور استريل كردن، دارو از ميكروفيلتر( ?m2/0) ساخت شركت Scheicher & Schuell آلمان گذرانده شده و درون ظرفهاي شيشه‌اي استريل ريخته مي‌شد. اين كار در مجاورت شعله چراغ الكلي صورت مي‌گرفت تا هواي محيط نيز استريل گردد. از حلال دارو استريل شده کهpH آن تنظيم شده بود، به عنوان محلول شاهد استفاده مي‌شد.
در اين تحقيق از غلظتهاي 5/12، 25 و 50 (ميلي گرم به ازاي يک کيلوگرم) حيوان استفاده شد.
3-2- جراحي حيوانات
در اين تحقيق از موشهاي صحرايي نر از نژاد Wistar در محدوده وزني 220-320 گرم استفاده شد. پس از آماده كردن وسايل جراحي استريل شده، حيوان توسط سديم پنتوباربيتال (mg/kg 40، داخل صفاقي) بيهوش مي گرديد(وادا 99و همکاران،1993).
موشهاي مورد نظر از خانه حيوانات واقع در دانشگاه علوم پزشكي سبزوار (معاونت آموزشي و تحقيقات و فن آوري) تهيه شدند. تمام شرايط نگهداري بر اساس كميته اخلاق دانشگاه در مورد اصول كار با حيوانات رعايت شد. دما در محدوده 1±22 درجه سانتي گراد و زمان روشنايي 7 صبح تا 7 شب بود. غذا و آب به طور كامل در دسترس حيوانات بود و هر 4 حيوان در يك قفس نگه داري مي شدند.
موهاي سر حيوان تراشيده شده و حيوان در دستگاه استريوتاكس قرار مي گرفت. بعد از ثابت كردن سر حيوان و شستشوي پوست سر با بتادين، برشي در خط وسط با تيغ جراحي ايجاد مي شد و سطح استخوان جمجمه با الكل تميز مي گرديد تا نقطه برگما مشخص شود. موقعيت مسير پرفورنت براي قرار دادن الکترودهاي تحريکي در سطح جمجه نسبت به برگما (بر حسب ميليمتر: 9/6-AP= 1/4+L= و 7/2 تا4/2V= نسبت به سطح استخوان جمجمه) و همچنين ژيروس دندانه دار براي قرار دادن الکترود ثبات نسبت به برگما (بر حسب ميليمتر: 8/2- AP= ، 8/1+L= و 5/3 تا 2/3 V=نسبت به سخت شامه) تعيين مي گرديد. موقعيت بطن جانبي راست (براي قرار دادن كانول راهنما) نيز مشخص مي شد (بر حسب ميليمتر: 9/0-AP= ، 5/1+L= نسبت به برگما و 2/3V= نسبت به سطح سخت شامه)(پاکسينوس و واتسون100،1989).
پس از تعيين دقيق نقطه هاي فوق بر روي جمجمه با استفاده از مته دستي، جمجمه را در آن نقطه سوراخ کرده و سپس الكترودهاي تحريك و ثبات و كانول راهنما به ترتيب در محل هاي تعيين شده قرار مي گرفتند. با استفاده از استيمولاتور، تحريك الكتريكي با شدت 50 ميكروآمپر تا 1 ميلي آمپر از طريق الكترود تحريك به مسير پرفورنت اعمال مي شد. در صورت قرار داشتن الكترودها در محل مناسب، به دنبال اعمال تحريک با يک تک پالس fEPSP ثبت مي گرديد، در غير اين صورت موقعيت الكترودهاي تحريك و ثبات آنقدر تغيير داده مي شد تا يك fEPSP با حداكثر دامنه (بين 10-3 ميلي ولت) ثبت شود. سپس با سيمان دندانپزشكي كانول راهنما‍ و الكترودها بر روي جمجمه حيوان ثابت مي گرديدند.
3-3- تحريک حيوانات
براي ثبت پتانسيلهاي ميداني مسير پرفورنت تحريک و از سلولهاي گرانولي ژيروس دندانه دار ثبت به عمل مي آمد (شکل3-1). از دستگاه تحريک براي تحريک حيوانات (کيندلينگ و LFS) استفاده مي شد. مسير پرفورنت توسط الکترودي که در آن کار گذاشته مي شد تحريک مي گرديد. الگوي تحريک به اين ترتيب بود: 1/0 هرتز، مدت زمان هر پالس 100 ميکرو ثانيه و شدت پالس آزمون (Test pulse؛ شدتي که در آن 50% حداکثر پاسخ به دست آيد).
شکل3-1: نمونه اي از ثبت پتانسيل ميداني ناحيه شکنج دندانه دار پس از تحريک تک پالس
3-4- ثبت پتانسيلهاي ميداني
براي ثبت کميتهاي الکتروفيزولوژيک از آمپلي فاير، برد A/D و برنامه نرم افزاري Neurotrace ساخت شرکت پرتودانش که مخصوص ثبت EEG و پتانسيلهاي ميداني است؛ استفاده مي شد. درهر آزمايش شيب پتانسيل هاي ميداني پس سيناپسي تحريکي101(fEPSP)، (شيب خط خاکستري در نمونه ثبت شکل 3-1) و دامنه اسپايک هاي تجمعي102( PS) که ميانگين جمع جبري مقادير خطوط نقطه چين در (شکل 3-1) مي باشد محاسبه مي شد.
3-5- روش تزريق دارو
براي تزريق دارو به داخل بطن جانبي، از لوله پلي اتيلني PE-20 (ساخت شركت Stoelting،آمريکا) كه يك سر آن به سر سوزن G 27 متصل شده بود، استفاده گرديد. قبل از تزريق دارو، لوله مزبور و سرسوزن كه ابتدا با آب مقطر استريل و سپس با داروي استريل شستشو داده مي‌شدند، از دارو پر شده سپس لوله پلي اتيلني به سرنگ‌ هاميلتون متصل مي گرديد. در نهايت سرنگ ‌هاميلتون در محل مخصوص بر روي دستگاه تزريق Microsyring pump)؛ ساخت شركت Stoelting آمريکا) قرار مي‌گرفت و سرعت تزريق روي 5/0 ميكروليتر در 2 دقيقه تنظيم مي‌شد (شکل 3-2).

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید