شکل3-2: نحوه تزريق دارو به داخل بطن جانبي با استفاده از پمپ تزريق (a) و سرنگ هاميلتون (b)
3-6- کيندلينگ حيوانات بوسيله PTZ
به منظور ايجاد کيندلينگ تزريق داخل صفاقيPTZ (mg/kg 37)) خريداري از شرکت سيگما، آلمان) هر 48 ساعت يک بار صورت مي گرفت. به دنبال تزريق PTZ مراحل تشنجي در حيوان ظاهر مي شد. اين مراحل به صورت پيشرونده با تکرار تزريقات تا مرحله 5 (آخرين مرحله از درجه بندي راسين) مي رسيد(راسين،1972). به بيان ديگر در تزريق هاي اوليه مراحل 1 تا 2 و در تزريق هاي بعدي مراحل بالاتر تشنجي بروز مي کرد. کميت هاي قابل اندازه گيري و قابل قياس آماري در اين تحقيق عبارت بودند از: مدت زمان تأخيري تا بروز اولين مرحله تشنج (Stage 1 Latency; S1L)، مدت زمان تأخيري تا مرحله 4 تشنج (Stage 4 Latency; S4L) و مدت زمان مرحله 5 تشنج (Seizure 5 Duration; S5D) ثبت مي شد.
3-7-گروههاي آزمايشي
به صورت تصادفي 5 گروه موش صحرايي نر نژاد Wistar در محدوده وزني 220 تا 320 گرم انتخاب شدند (هر گروه 4 سر). گروههاي آزمايشي به قرار زير بودند:
1- گروه اول: اين حيوانات بدون هيچ گونه مداخله اي براي جراحي استرئوتاکسيک آماده شدند. نقاط مربوط به تحريک (مسير پرفورنت) و ثبت (شکنج دندانه اي) و تزريق دارو يا ACSF (بطن جانبي) بر اساس اطلس پاکسينوس مشخص شد. پس از قرار دادن الکترودهاي دوقطبي در مسير پرفورنت و الکترود ثبات در شکنج دندانه دار، شدت پالس آزمون تعيين شده و به مدت 20 دقيقه ثبت پايه پتانسيل هاي ميداني با تک پالس(LFP)انجام گرديد. پس از ثبت پتانسيل هاي ميداني تحريک تتانيک جهت ايجاد LTP القا شد. پس از اعمال تحريک تتانيک، دوباره ثبت پتانسيل هاي ميداني به مدت 20 دقيقه انجام گرفت. قبل از القاي LTP يک ميکروليتر ACSF نيز به داخل بطن جانبي تزريق شد (شکل3-3).
شکل3-3: پروتوکل زماني گروه1(غيرکيندل)از آغاز جراحي تا آخرين ثبت گرفته شده. اين گروه PTZ و WAY-100635 دريافت نکرده است.
2- گروه دوم: تمام مراحل انجام آزمايش مشابه گروه اول بود با اين تفاوت که حيوانات قبل از جراحي طي دوره يک ماهه تزريق PTZ کيندل شده بودند(شکل3-4).
شکل3-4: پروتوکل زماني گروه2(کنترل کيندل)از آغاز جراحي تا آخرين ثبت گرفته شده. اين گروه PTZ دريافت کرده و حيوانات کيندل شده اند.
3- گروه سوم: تمامي مراحل انجام آزمايش مشابه گروه دوم بود با اين تفاوت که به جاي ACSF آنتاگونيست گيرنده ي 5-HT1A سرتونيني (WAY-100635) با غلظت 5/12 نانومولار تزريق داخل بطني مي شد، همچنين بعد از تزريق آنتاگونيست و قبل از القاي LTP 20 دقيقه ثبت نيز گرفته مي شد (شکل3-5).
4- گروه چهارم: تمامي مراحل انجام آزمايش مشابه گروه دوم بود با اين تفاوت که به جاي ACSF آنتاگونيست گيرنده ي 5-HT1A سرتونيني (WAY-100635) با غلظت 25 نانومولار تزريق داخل بطني مي شد، همچنين بعد از تزريق آنتاگونيست و قبل از القاي LTP 20 دقيقه ثبت نيز گرفته مي شد (شکل3-5).
5- گروه پنجم: تمامي مراحل انجام آزمايش مشابه گروه دوم بود با اين تفاوت که به جاي ACSF آنتاگونيست گيرنده ي 5-HT1A سرتونيني (WAY-100635) با غلظت 50 نانومولار تزريق داخل بطني مي شد همچنين بعد از تزريق آنتاگونيست و قبل از القاي LTP 20 دقيقه ثبت نيز گرفته مي شد (شکل3-5).
شکل3-5: پروتوکل زماني گروه هاي 3 ، 4 و 5(گروه هاي درمان کيندل) از آغاز جراحي تا آخرين ثبت گرفته شده. به اين گروه ها PTZ تزريق شده و کيندل شده اند و به جاي ACSF آنتاگونيست گيرنده ي 5-HT1A سرتونيني (WAY-100635) با غلظت هاي 5/12 ، 25 و 50 نانومولار تزريق داخل بطني شده است، همچنين بعد از تزريق آنتاگونيست و قبل از القاي LTP نيز 20 دقيقه ثبت گرفته شد.
3-8- روش تجزيه و تحليل آماري
براي تجزيه و تحليل آماري از نرم افزار Statistica استفاده شد. براي مقايسه غلظت هاي مختلف WAY-100635 بر کميت هاي تشنج از آزمون ANOVA دو طرفه و پس آزمون Tukey استفاده شد. جهت نمايش اختلاف بين داده ها، با استفاده از آزمون t-غير زوجها هر يک از کميت هاي با کنترل مربوطه، استفاده گرديد.
فصل چهارم
نتايج
4-1- تأييد بافت شناسي
ارزيابي بافت شناسي نشان داد كه الكترودها در موقعيت خود (شكنج دندانه دار) قرار داشتند و در محل تحريك وثبت هيچ گونه آسيب بافتي مشاهده نشد (شکل 4-1).
الف)
ب)
شکل 4-1 : موقعيت شکنج دندانه دار در مغز انسان.الف) نمايي از برش کرنال در ناحيه شکنج دندانه دار از اطلس پاکسينوس و واتسون[77]. ب) تصوير ميکروسکوپ نوري از ناحيه شکنج دندانه دار پس از رنگ آميزي نيسل، همانطور که نشان داده شده الکترود ثبت در ناحيه گرانولي شکنج دندانه دار است.
حيوانات گروه هاي کيندل (گروه 2تا5) به مدت يک ماه توسط تزريق روز در ميان PTZ کيندل شدند. به منظور ايجاد کيندلينگ، تزريق داخل صفاقي PTZ (mg/kg 37) هر 48 ساعت يک بار صورت مي گرفت. براي هر بار تزريق، حيوانات وزن کشي مي شدند و با توجه به وزن آنها PTZ در سالين حل مي شد. به دنبال تزريق PTZ مراحل تشنجي در حيوان ظاهر مي شد. کيندلينگ کامل حيوان معمولا از تزريق پنجم به بعد صورت مي گرفت به عبارتي ديگر در تزريق هاي اوليه مراحل 1 تا 2 و در تزريق هاي بعدي مراحل بالاتر تشنجي بروز مي کرد.تعدادي از رت ها که مرحله 5 با شدت بيشتر و زمان طولاني تري در آن ها بروز مي کرد، تعادل خود را از دست داده و روي زمين مي افتادند و بعد از زماني کوتاه مي مردند. حيواناتي که طي سه تزريق متوالي مرحله 5 تشنج را در تزريقات PTZ به طور مکرر نشان مي دادند و بعد از مدت زماني تعادل خود را بدست مي آوردند حيوان کاملأ کيندل شده ناميده مي شدند و پس از رسيدن به اين مرحله اين اثر براي مدت طولاني شايد براي تمام طول زندگي حيوان ثابت مي ماند.
حيوانات کيندل شده بدون هيچ گونه مداخله اي براي جراحي استرئوتاکسيک آماده مي شدند. پس از جراحي و قرار دادن الکترود ثبت(شکنج دندانه اي) و تحريک(مسير پرفورنت) در محل هاي مورد نظر، ثبت پتانسيلهاي ميداني103 (LFP) و تحريک تتانيک (القا LTP) انجام شد. سپس براي بررسي اثر اعمال تحريک تتانيک بر پتانسيل هاي ميداني در حيوانات دست نخورده (بدون تزريق PTZ) آزمايش اول طراحي شد.
4-2- نتايج آزمايش اول
شدت پالس آزمون براي گروههاي 1تا 5، به ترتيب 7/1667/666، 68/2881300، 4/1767/1466، 6/290±3/1133 و 3/133±7/866(بر حسب ميكرو آمپر) بود و آزمونANOVA يک طرفه تفاوت معني داري را بين اين کميت نشان نداد. به عبارت ديگر تحريک پذيري سيناپسي در گروههاي مختلف در شروع آزمايشها يکسان بود.
در اين آزمايش از حيوانات گروه 1(گروه غير کيندل) به مدت 20 دقيقه ثبت پايه پتانسيل هاي ميداني با تک پالس(LFP) انجام گرديد. پس از ثبت پتانسيل هاي ميداني تحريک تتانيک جهت ايجاد LTP القا شد. پس از اعمال تحريک تتانيک، دوباره ثبت پتانسيل هاي ميداني به مدت 20 دقيقه انجام گرفت.شيب پتانسيل هاي ميداني(fEPSP)و دامنه اسپايک هاي تجمعي(PS)اين حيوانات قبل و بعد از القاي LTP مقايسه و تاثير آن مشخص شد.
4-2-1- اثر اعمال تحريک تتانيک بر پتانسيل هاي ميداني در حيوانات دست نخورده(بدون تزريق PTZ)
همانطور که در بخش هاي پيش گفته شد؛ شيب پتانسيل هاي ميداني(fEPSP) و دامنه اسپايک هاي تجمعي(PS) اين حيوانات قبل و بعد از القاي LTP مقايسه شد. در اين گروه تحريک تتانيک (القاي (LTP، شيب پتانسيلهاي ميداني(نمودار1-2-4 A) و دامنه اسپايكهاي تجمعي(نمودار 1-2-4 B) را به طور معناداري افزايش داد(p0.001).
نمودار1-2-4 A اثر اعمال تحريک تتانيک بر دامنه اسپايک هاي تجمعي در گروه1 (غير کيندل). از حيوانات اين گروه 20 دقيقه ثبت LFP گرفته شد و به مدت 2 دقيقه تحريک تتانيک جهت القاي LTP اعمال شد. سپس مجددا 20 دقيقه ثبت LFP انجام گرفت. بعد از القاي LTP ، دامنه اسپايک هاي تجمعي (PS) به طور معناداري افزايش پيدا کرد p0.001)). مقادير به صورت ميانگين ± خطاي معيار ميانگين و بر حسب درصد مي باشند. در اين گروه تعداد حيوانات 4 سر مي باشد(n=4).
نمودار1-2-4 B اثر اعمال تحريک تتانيک بر شيب پتانسيل هاي ميداني در گروه1 (غير کيندل). از حيوانات اين گروه 20 دقيقه ثبت LFP گرفته شد و به مدت 2 دقيقه تحريک تتانيک جهت القاي LTP اعمال شد. سپس مجددا 20 دقيقه ثبت LFP انجام گرفت. بعد از القاي LTP ، شيب پتانسيل هاي ميداني(fEPSP)، به طور معناداري افزايش پيدا کرد p0.001)). مقادير به صورت ميانگين ± خطاي معيار ميانگين و بر حسب درصد مي باشند. در اين گروه تعداد حيوانات 4 سر مي باشد(n=4).
4-3- نتايج آزمايش دوم
همانطور که در آزمايش اول نشان داده شد، با به كار بردن LTP، شيب پتانسيل هاي ميداني و دامنه اسپايك هاي تجمعي به طور معناداري افزايش پيدا کرد. براي اينکه مشخص شود آيا گيرنده هاي سروتونيني در اثر تقويتي LTP نقشي دارد يا خير، آزمايش دوم طراحي و انجام شد. در اين آزمايش، تزريق آنتاگونيست گيرنده ي 5-HT1A سرتونيني (WAY-100635) با غلظتهاي 5/12، 25 و 50 نانومولار به داخل بطن جانبي در گروه هايي که PTZ دريافت کرده و کيندل شده بودند(گروه3 تا 5)، نسبت به گروه 2 که فقط کيندل شده بودند(گروه کنترل کيندل)، بسته به دوز دارو شيب پتانسيل هاي ميداني(fEPSP) و دامنه اسپايک هاي تجمعي(PS) بعد از تزريق آنتاگونيست و القاي LTP به طور معناداري کاهش پيدا کرد.
4-3-1- بررسي نقش گيرنده هاي سروتونين بر اثر بخشي تحريک تتانيک در حيوانات کيندل (با تزريق PTZ)
در اين آزمايش از حيوانات گروه 2(کنترل کيندل) که طي دوره يک ماهه تزريق PTZ کيندل شده بودند؛ به مدت 20 دقيقه ثبت پايه پتانسيل هاي ميداني با تک پالس(LFP) انجام گرديد. پس از ثبت پتانسيل هاي ميداني تحريک تتانيک جهت ايجاد LTP القا شد. پس از القاي تحريک تتانيک، دوباره ثبت پتانسيل هاي ميداني به مدت 20 دقيقه انجام گرفت.شيب پتانسيل هاي ميداني(fEPSP) و دامنه اسپايک هاي تجمعي(PS) اين حيوانات قبل و بعد از القايLTP مقايسه و تاثير آن مشخص شد.
در اين گروه تحريک تتانيک (القاي (LTP،شيب پتانسيلهاي ميداني (نمودار1-3-4 A) و دامنه اسپايكهاي تجمعي (نمودار1-3-4 B) را به طور معناداري افزايش داد(p0.001).
نمودار1-3-4 A اثر اعمال تحريک تتانيک بر دامنه اسپايک هاي تجمعي در گروه 2(کنترل کيندل). از حيوانات اين گروه که طي دوره يک ماهه تزريق PTZ کيندل شده بودند؛ 20 دقيقه ثبت LFP گرفته شد و به مدت 2 دقيقه تحريک تتانيک جهت القاي LTP اعمال شد. سپس مجددا 20 دقيقه ثبت LFP انجام گرفت. بعد از القاي LTP ، دامنه اسپايک هاي تجمعي (PS) به طور معناداري افزايش پيدا کرد p0.001)). مقادير به صورت ميانگين ± خطاي معيار ميانگين و بر حسب درصد مي باشند. در اين گروه تعداد حيوانات 4 سر مي باشد(n=4).
نمودار1-3-4 B اثر اعمال تحريک تتانيک بر شيب پتانسيل هاي ميداني در گروه2( کنترل کيندل). از حيوانات اين گروه20 دقيقه ثبت LFP گرفته شد و به مدت 2 دقيقه تحريک تتانيک جهت القاي LTP اعمال شد. سپس مجددا 20 دقيقه ثبت LFP انجام گرفت. بعد از القاي LTP ، شيب پتانسيل هاي ميداني(fEPSP)، به طور معناداري

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید